荧光作为物质光致发光的冷发光现象,在科研与工业众多领域发挥着至关重要的作用。精准表征物质的基本荧光性能,有助于深入探究材料特性,进而推动相关领域的发展。当前,荧光分光光度计和稳态瞬态荧光光谱仪是常用的表征工具。常规荧光光谱仪可以获取物质的激发光谱、发射光谱、量子产率、荧光寿命、三维荧光等信息,还能借助配置合适的附件,对磷光、上转换发光、变温光谱、荧光偏振以及激光诱导荧光等性能开展检测分析。
国仪光子自主研发的荧光量子效率测量仪系统JY - QEY6500 - PLS,有着非常强的竞争力。该系统大多数都用在测量材料(如溶液、粉末、薄膜)的荧光量子效率,其检测系统经可溯源光源定标,能精确测量绝对量子产率和色度,同时实现光致发光谱的测量与记录。除更换光源、取放样品等操作外,其余测量操作均可在软件界面完成,实现自动化测量,具备结构相对比较简单、操作便捷的优势。与传统荧光光谱仪相比,该系统测量稳定、快速、可靠,体积小且使用起来更便捷,为荧光探测和量子效率测量提供了低成本解决方案,适合高校和科研单位选购。
还有一些知名品牌的设备也大范围的应用于荧光检测。例如,专注于生产和研发高性能研究级光谱仪的公司推出的稳态瞬态荧光光谱仪,采用模块化搭建,专注于稳态及时间分辨光谱测试,灵敏度极高。搭配适宜的组件和附件,能满足荧光、量子产率、磷光、近红外、荧光寿命等一系列测试需求。其光源分为稳态光源和瞬态光源,稳态光源一般是光谱及能量连续输出的氙灯,用于稳态谱、量子产率测试;瞬态光源是频率可调、有特定脉宽的脉冲输出光源,如微秒灯、纳秒灯和皮秒脉冲激光器等,用于荧光寿命测试。探测器方面,内含高增益光电倍增管(PMT)检测器,适用于稳态谱和时间分辨过程中的光子计数收集,常见的有可见的红敏探测器和近红外探测器等,不同探测器有不同的光谱探测范围和工作时候的温度要求。
另外,部分设备在荧光量子产率测试方面表现出色。如有的绝对量子产率检测系统,测试波段覆盖从紫外到近红外短波区域,主要包含氙灯型激发光源、单色仪、积分球和能同步测量多个波长的多通道光的CCD探测器。与单通道光探测器PMT相比,该系统配置的CCD探测器具有多通道性,可读出一段光谱区域内的连续光谱,实现“全谱测定”,测试响应速度更快,特定波长范围下的相对检测噪音更低,且其模块化设置使光源、探测器等主要部件的配置更灵活。
激发光谱:固定发射光波长时,探测不同激发光波长条件下的发光强度,从而得到材料在该固定发射波长下的发射强度随激发波长变化的谱图。
发射光谱:固定激发光波长,探测不同发射波长处的发射强度,得到材料发射强度随发射波长变化的谱图。
量子产率:衡量物质发生荧光能力的指标,数值在0 - 1之间,反映了荧光辐射与其他辐射和非辐射跃迁竞争的结果,可细分为内量子产率和外量子产率。
荧光寿命:激发停止后,分子的荧光强度降至激发时最大强度的1/e所需的时间,代表粒子在激发态存在的平均时间,即激发态的荧光寿命。
上转换发光:又称反 - 斯托克斯发光。与斯托克斯定律中材料只能受高能量短波长光激发并发出低能量长波长光不同,上转换发光材料在长波长激发下,能持续发射波长比激发波长短的光。
温度猝灭:受发光材料特性和热稳定性影响,随着温度上升,发光材料的发光强度下降,发射光谱出现红移现象。
不同设备在常规激发发射谱测试中各具特点。部分光谱仪自带滤光片功能,通常不需要额外添加滤光片。发射光谱扫描一般从激发波长往后20 - 30 nm处开始,最长一般扫到870 nm。常规光谱也可用小光谱仪测试,但可能受倍频峰影响,如325 nm激发在650 nm处也许会出现倍频峰,若倍频峰在光谱测定范围内有影响,测试时可加适当滤光片尽量消除。小光谱仪测试速度快,更适合测动力学过程,也适用于薄膜等荧光较弱、对分辨率要求不高的样品。
量子产率是评估材料荧光性能的关键指标,分为内量子产率和外量子产率。内量子产率是产生的光子数与样品吸收的光子数之比,外量子产率是产生的光子数与所有入射的光子数之比。由于内量子效率乘以吸收系数等于外量子效率,且吸收系数小于1,所以内量子产率高于外量子产率。同时,内量子产率与发射谱强度并不等同,样品荧光强、发射谱强度高不代表量子产率也高。测量子产率时,需用积分球收集所有散射光和发射光,先后测试样品和参比样两条曲线。测固体样通常选BaSO₄标样或空的石英皿作参比,测液体样通常选对应的溶剂作参比。通过发射光子和吸收光子数的比值,可计算出内量子产率。国仪光子的JY - QEY6500 - PLS系统在量子产率测量方面表现出色,能为科研工作者提供准确可靠的数据。
在激发光源照射下,荧光体系向各个方向发出荧光,光源停止照射后,荧光会逐渐衰减到零。激发停止后,分子荧光强度降至激发时最大强度的1/e所需的时间即为该荧光体系的寿命。荧光寿命本质上测试的是样品某波长发射的时间衰减曲线,即时间分辨衰减谱。与测稳态谱不同,寿命测试需选择正真适合的脉冲光源,并调整好脉冲频率。利用一定波长的脉冲光激发样品,监测某个波长的发射强度在不同时间通道累积的光子数,记录具体某一波长的荧光强度随时间的变化。时间相关单光子计数(TCSPC)技术是目前最成熟、最准确的荧光寿命测定方法。测试结果除了荧光衰减曲线外,一般还有相应的寿命拟合结果,包括拟合曲线、加权残差、拟合的寿命及其对应的占比。平均寿命可通过相关公式计算获得,当置信因子在0.8 - 1.3之间时,拟合结果可靠适用。
近红外光谱:随着科学技术发展,发光在近红外第一窗口(700 nm - 900 nm)和近红外第二窗口(1000 nm - 1700 nm)的材料受到广泛关注。在生物成像领域,近红外发光材料具备优良生物组织穿透性和低背景荧光干扰的优势。近红外光谱测试需用到近红外区的探测器,如近红外的PMT探测器、Si基探测器或InGaAs光电探测器。实际应用中,使用某些配备近红外PMT探测器的设备测试时,需先将探测器外加液氮制冷达到77 K,以最大限度减小暗噪声,光谱扫描范围建议在800 - 1600 nm,且由于和可见光属不同探测器,一般不再测试激发谱。
磷光/延迟荧光光谱:磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。对于特定体系材料,磷光的发光波长比荧光长,而延迟荧光的峰位和荧光保持一致。在实测中,有时间分辨的发射光谱(TRES)方法和配置带有门控功能的PMT检测器两种常用方法来分离磷光、延迟荧光与荧光。
上转换发光:材料在长波长激发下能持续发射波长比激发波长短的光。上转换过程有激发态吸收、能量传递及光子雪崩三种形式,测试常用808 nm、980 nm激光器作为光源。目前,上转换材料主要是稀土元素掺杂的固体化合物,利用稀土元素的亚稳态特性,可将人眼不可见的近红外光转化为可见光。
热猝灭:即温度猝灭,是发光材料都会存在的现象,还在于无辐射跃迁几率随温度上升而增大。在材料实际应用中,发光材料工作时候的温度常高于室内温度,因此研究材料的热猝灭性能和机理,可为制备高效和高工作时候的温度的荧光材料提供参考。部分仪器可通过配置的冷热台、冷却循环水系统(测低温用)实现样品的变温测试。
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